Visualiser in situ la machinerie de transport nucléaire désordonnée

Nature volume 617, pages 162-169 (2023)Citer cet article

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Le complexe de pores nucléaires (NPC) des mammifères, d'environ 120 MDa, agit comme un gardien du transport entre le noyau et le cytosol1. Le canal central du NPC est rempli de centaines de protéines intrinsèquement désordonnées (IDP) appelées FG-nucléoporines (FG-NUP)2,3. Bien que la structure de l'échafaudage NPC ait été résolue de manière remarquablement détaillée, la machinerie de transport réelle construite par les FG-NUP - environ 50 MDa - est représentée comme un trou d'environ 60 nm, même dans les tomogrammes et/ou les structures hautement résolus calculés avec des techniques artificielles. intelligence4,5,6,7,8,9,10,11. Ici, nous avons directement sondé les conformations du FG-NUP98 vital à l'intérieur des PNJ dans des cellules vivantes et dans des cellules perméabilisées avec une machinerie de transport intacte en utilisant une approche de marquage de petites molécules spécifique au site, basée sur la biologie synthétique, associée à une microscopie à fluorescence hautement résolue dans le temps. Les mesures de cellules perméabilisées uniques de la distribution de distance des segments FG-NUP98, combinées à des simulations moléculaires à gros grains du NPC, nous ont permis de cartographier l'environnement moléculaire inexploré à l'intérieur du canal de transport de taille nanométrique. Nous avons déterminé que le canal fournit – selon la terminologie de la théorie des polymères de Flory12 – un « bon environnement de solvant ». Cela permet au domaine FG d'adopter des conformations élargies et ainsi de contrôler le transport entre le noyau et le cytoplasme. Avec plus de 30 % du protéome formé à partir de PDI, notre étude ouvre une fenêtre sur la résolution des relations désordre-fonction des PDI in situ, qui sont importantes dans divers processus, tels que la signalisation cellulaire, la séparation de phase, le vieillissement et l'entrée virale.

Les IDP sont des macromolécules flexibles et dynamiques dépourvues de structure tertiaire fixe et pouvant adopter une gamme de conformations pour remplir diverses fonctions dans la cellule. Les déplacés internes sont très pertinents pour la physiologie humaine et jouent un rôle central, entre autres, dans les maladies neurodégénératives du vieillissement et le cancer. Les PDI sont également des acteurs clés dans la séparation de phases et sont impliqués dans la formation de condensats biomoléculaires13,14,15,16,17,18,19,20,21. Dans le NPC nanométrique, qui a un poids moléculaire total d'environ 120 MDa chez les mammifères, il existe des centaines d'IDP enrichis en résidus phénylalanine (F) et glycine (G), connus sous le nom de FG-NUPs1. Les FG-NUP forment une barrière de perméabilité dans le canal central du NPC, qui régule le transport nucléocytoplasmique en restreignant le passage des grosses cargaisons à moins qu'elles ne présentent une séquence de localisation nucléaire ou une séquence d'exportation nucléaire2,3. Les récepteurs de transport nucléaire peuvent reconnaître spécifiquement ces séquences et transporter efficacement la cargaison à travers la barrière. Grâce aux progrès récents en matière de cryo-tomographie électronique, de cristallographie, de protéomique et de prédiction de structure basée sur l'intelligence artificielle (IA), environ 70 MDa de l'échafaudage NPC entourant le canal central ont été résolus avec une résolution proche de l'atome4,5,6,7,8. ,9,10,11. Cependant, les signaux provenant des FG-NUP hautement dynamiques ne sont généralement pas accessibles à ces techniques de biologie structurale, et la machinerie de transport réelle à l'intérieur du canal central (environ 50 MDa supplémentaires) n'est pas capturée, laissant un trou d'environ 60 nm dans le canal central. centre de la structure de l'échafaudage. Par conséquent, l’état conformationnel des protéines à l’intérieur du NPC reste insaisissable, ce qui a conduit à plusieurs hypothèses partiellement contradictoires sur les morphologies des domaines FG dans leur état fonctionnel22,23,24,25,26,27,28. Avec environ 30 % de l’ensemble du protéome eucaryote étant intrinsèquement désordonné, le problème de la difficulté à étudier l’état conformationnel dans les cellules s’étend bien au-delà de la biologie des PNJ. Outre les techniques de résonance magnétique et de diffusion 13,14, la fluorescence d'une seule molécule de protéines purifiées et marquées est devenue un outil puissant pour sonder les conformations des protéines en solution ; des études avancées ont même montré que cela est possible dans les cellules si de telles sondes sont micro-injectées29,30,31. Cependant, le NPC n’est assemblé qu’à la fin de la mitose et pendant la croissance nucléaire en interphase32, et son marquage nécessite donc un codage génétique. Les technologies établies basées sur les protéines fluorescentes telles que la GFP ou les étiquettes protéiques auto-marquées telles que SNAP-tag33 ne permettent cependant pas facilement l'extraction de distributions de distances multiples pour la même protéine, en raison de la taille même de l'étiquette fluorescente et de la nature inhérente de celle-ci. liberté d'étiquetage limitée.

0.5) and compactify in poor solvents (ν < 0.5)45. Flory’s theory can be further extended to describe densely grafted polymer brushes where ν ~ 1 (ref. 46). Note that the scaling law is derived for infinitely long homopolymers. Despite its limiting definition, the law has been applied to calculate an apparent scaling exponent for finite-length proteins30,47. In brief, the apparent scaling exponent captures a complex distance distribution in one number and thus provides excellent economy in describing how protein conformational changes are tuned by their environment./p> 0.5), reminiscent of the chain conformations in polymer melts12. On top of that, the presence of nuclear transport receptors, which exist in large quantities in the NPC49 (Extended Data Fig. 3e,f), and post-translational modifications (for example, glycosylation50 and phosphorylation), as well as transport cargos such as proteins and RNAs, could also contribute to good solvent conditions./p> 0.5) in which the FG domains adopt extended conformations compared with the collapsed solution state in vitro./p> 0.5). Our study removes much speculation about the conformational state of FG-NUPs in the NPC and provides a sound coarse-grained model with amino acid precision to explain the function of the permeability barrier. The measured apparent scaling exponent ν = 0.56 ± 0.03 disaccords with, for example, the polymer brush model46 (ν ~ 1) and the forest model24 (ν ~ 0.3), which describes the low charge-content, cohesive FG domain as a globular structure. Remarkably, we also showed that the parameterization based on in vitro reconstitution studies failed to reproduce a functional pore. Despite having similar permeability barrier properties as the intact NPC, the bulk condensate formed from phase separating NUP98 is an incomplete approximation of the actual permeability barrier, the materials properties of which are modulated by the anchoring of a distinct number of FG-NUPs with 3D precision on a half-toroidal NPC scaffold. In terms of nuclear transport selectivity, there are consequences: whereas a surface condensate would leave a substantial hole at the centre, we found the hole to be filled by FG-NUPs at near-critical conditions (Fig. 4b). These results emphasize the importance of interrogating the permeability barrier in situ to reconcile different transport models and understand the molecular basis for nuclear transport./p>